Електронна мікроскопія

Електронна мікроскопія - це метод дослідження структур, що знаходяться поза межами видимості світлового мікроскопа і мають розміри менше одного мікрона (від 1 мкм до 1-5 Å).
Дія електронного мікроскопа (рис.) засноване на використанні спрямованого потоку електронів, який виконує роль світлового променя в світловому мікроскопі, а роль лінз грають магніти (магнітні лінзи).
Внаслідок того, що різні ділянки досліджуваного об'єкта по-різному затримують електрони, на екрані електронного мікроскопа виходить чорно-біле зображення досліджуваного об'єкта, збільшена в десятки і сотні тисяч раз. В біології і медицині в основному використовуються електронні мікроскопи просвітчастого типу.
Електронна мікроскопія виникла в 30-х роках, коли були отримані перші зображення деяких вірусів (вірусу тютюнової мозаїки та бактеріофагів). В даний час електронна мікроскопія знайшла найбільш широке застосування в цитології, мікробіології і вірусології, зумовивши створення нових галузей науки. При електронній мікроскопії біологічних об'єктів застосовують спеціальні методи приготування препаратів. Це необхідно для виявлення окремих компонентів досліджуваних об'єктів (клітини, бактерії, вірусу і т. д.), а також для збереження їх структури в умовах високого вакууму під пучком електронів. За допомогою електронної мікроскопії вивчається зовнішня форма об'єкта, молекулярна організація його поверхні, з допомогою методу ультратонких зрізів досліджується внутрішню будову об'єкта.
Електронна мікроскопія в поєднанні з біохімічними, цитохимическими методами дослідження, иммунофлюоресценцией, а також рентгеноструктурним аналізом дозволяють судити про склад і функції структурних елементів клітин і вірусів.
електронний мікроскоп
Електронний мікроскоп 70-х років минулого століття

Електронна мікроскопія - вивчення мікроскопічних об'єктів за допомогою електронного мікроскопа.
Електронний мікроскоп являє електронно-оптичний інструмент, що володіє роздільною здатністю в декілька ангстрем дозволяє візуально вивчати тонка будова мікроскопічних структур і навіть деяких молекул.
В якості джерела електронів для створення електронного пучка, що заміняє світловий пучок, служить трехэлектродная гармата, що складається з катода, керуючого електрода і анода (рис. 1).

Рис. 1. Трехэлектродная гармата: 1 - катод; 2 - керуючий електрод; 3 - пучок електронів; 4 - анод.

Електромагнітні лінзи, вживані в електронному мікроскопі замість оптичних, представляють багатошарові соленоїди, укладені в панцирі з магнітно-м'якого матеріалу, мають на внутрішній стороні немагнітний зазор (рис. 2).

Рис. 2. Електромагнітна лінза: 1 - полюсний наконечник; 2 - латунне кільце; 3 - обмотка; 4 - панцир.

Електричні і магнітні поля, створювані в електронному мікроскопі, є аксіально симетричними. Завдяки дії цих полів заряджені частинки (електрони), що виходять з однієї точки об'єкта в межах невеликого кута, знову збираються в площині зображення. Вся електронно-оптична система укладена в колоні електронного мікроскопа (рис. 3).

Рис. 3. Електронно-оптична система: 1 - керуючий електрод; 2 - діафрагма першого конденсатора; 3 - діафрагма другого конденсатора; 4 - стигматор другого конденсатора; 5 - об'єкт; 6 - лінза об'єктива; 7 - стигматор лінзи об'єктива; 8 - стигматор проміжної лінзи; 9 - діафрагма проекційної лінзи; 10 - катод; 11 - анод; 12 - перший конденсатор; 13 - другий конденсатор; 14 - коректор фокусування; 15 - столик объектодержателя; 16 - діафрагма лінзи об'єктива; 17 - селекторний діафрагма; 18 - проміжна лінза; 19 - проекційна лінза; 20 - екран.

Створений електронною гарматою пучок електронів направляється в полі дії конденсорных лінз, які дозволяють у широких межах змінювати щільність, діаметр і апертуру пучка, що падає на досліджуваний об'єкт. В камері об'єкта встановлений столик, конструкція якого забезпечує переміщення об'єкта у взаємно перпендикулярних напрямках. При цьому можна послідовно оглянути площу, рівну 4 мм2, і вибрати найбільш цікаві ділянки.
За камерою об'єкта розташована лінза об'єктива, яка дозволяє досягати різкого зображення об'єкта. Вона ж дає перше збільшене зображення об'єкта, і з допомогою наступних, проміжної і проекційної, лінз загальне збільшення можна довести до максимального. Зображення об'єкта виникає на екрані, люминесцирующем під дією електронів. За екраном розташовані фотопластини. Стабільність дії електронної гармати, а також чіткість зображення поряд з іншими факторами (сталість високої напруги та ін) багато в чому залежать від глибини розрідження в колоні електронного мікроскопа, тому якість роботи приладу в значній мірі визначається вакуумною системою (насоси, канали відкачування, крани, клапани, ущільнення) (рис. 4). Необхідне розрідження всередині колони досягається завдяки високій ефективності вакуумних насосів.
Попереднє розрідження у всій вакуумній системі створює механічний форвакуумний насос, потім вступає в дію масляний дифузійний насос; обидва насоса включені послідовно і забезпечують в колоні мікроскопа високе розрідження. Введення в систему електронного мікроскопа масляного бустерного насоса дозволило на тривалий час відключати форвакуумний насос.

Рис. 4. Вакуумна схема електронного мікроскопа: 1 - пастка, охолоджувана рідким азотом (хладопровод); 2 - високовакуумний кран; 3 - дифузійний насос; 4 - обхідний клапан; 5 - малий буферний балон; 6 - бустерний насос; 7 - механічний форвакуумний насос попереднього розрідження; 8 - чотирьохходовий клапанний кран; 9 - великий буферний балон; 10 - колона електронного мікроскопа; 11 - клапан напуску повітря в колону мікроскопа.

Електрична схема мікроскопа складається з джерел високої напруги, напруження катода, живлення електромагнітних лінз, а також системи, що забезпечує змінним мережевим напругою електродвигун форвакуумного насоса, піч дифузійного насоса і освітлення пульта управління. До живлячої пристрою пред'являються дуже високі вимоги: наприклад, для высокоразрешающего електронного мікроскопа ступінь нестабільності високої напруги не повинна перевищувати 5·10-6 за 30 сек.
Інтенсивний електронний пучок утворюється в результаті термоемісії. Джерелом напруження катода, який представляє собою V-образну вольфрамову нитку, служить високочастотний генератор. Генерується напруга з частотою коливань 100-200 кГц забезпечує отримання електронного пучка монохроматичного. Харчування лінз електронного мікроскопа забезпечується постійним высокостабилизированным струмом.

Рис. 5. Електронний мікроскоп УЭМВ-100Б для дослідження живих мікроорганізмів.


Випускаються прилади (рис. 5) з гарантованою роздільною здатністю 4,5 Å; на окремих унікальних знімках отримано дозвіл 1,27 Å, що наближається до розміру атома. Корисне збільшення при цьому дорівнює 200 000.
Електронний мікроскоп - прецезионный прилад, який вимагає особливих методів приготування препаратів. Біологічні об'єкти малоконтрастны, тому доводиться штучно підсилювати контраст препарату. Є кілька способів підвищення контрастності препаратів. При оттенении препарату під кутом платиною, вольфрамом, вуглецем і т. д. стає можливим визначати на электронномикроскопических знімках розміри по всіх трьох осях просторової системи координат. При позитивному контрастуванні препарат з'єднується з водорозчинними солями важких металів (уранилацетат, моноокисел свинцю, перманганат калію та ін). При негативному контрастуванні препарат оточують тонким шаром аморфної речовини високої щільності, непроникного для електронів (молібденовокислий амоній, уранилацетат, фосфорно-вольфрамова кислота та ін).
Електронна мікроскопія вірусів (вирусоскопия) зумовила значний прогрес у вивченні ультратонкої, субмолекулярной структури вірусів (див.). Поряд з фізичними, біохімічними та генетичними методами дослідження застосування електронної мікроскопії сприяв також виникненню і розвитку молекулярної біології. Предметом вивчення цього нового розділу біології є субмикроскопическая організація і функціонування клітин людини, тварин, рослин, бактерій і мікоплазм, а також організація рикетсій і вірусів (рис. 6). Віруси, великі молекули білка і нуклеїнових кислот (РНК, ДНК), окремі фрагменти клітин (наприклад, молекулярна будова оболонки бактеріальних клітин) можна досліджувати за допомогою електронного мікроскопа після спеціальної обробки: відтінення металом, позитивного або негативного контрастування уранилацетатом або фосфорно-вольфрамовою кислотою, а також іншими сполуками (рис. 7).

Рис. 6. Клітка культури тканини серця мавпи циномольгус, інфікована вірусом натуральної віспи (X 12 000): 1 - ядро; 2 - мітохондрії; 3 - цитоплазма; 4 - вірус.
Рис. 7. Вірус грипу (негативне контрастування (Х450 000): 1 - оболонка; 2 - рибонуклеопротеид.

Методом негативного контрастування на поверхні багатьох вірусів були виявлені закономірно розташовані групи білкових молекул - капсомеры (рис. 8).

Рис. 8. Фрагмент поверхні капсиду вірусу герпесу. Видно окремі капсомеры (X500 000): 1 - вигляд збоку; 2 - вигляд зверху.
Рис. 9. Ультратонкий зріз бактерії Salmonella typhimurium (Х80 000): 1 - ядро; 2 - оболонка; 3 - цитоплазма.

Внутрішня будова бактерій і вірусів, а також інших, більш великих біологічних об'єктів можна вивчати тільки після розтину їх за допомогою ультратома і приготування тонких зрізів товщиною 100-300 Å. (рис. 9). Завдяки покращенню методів фіксації, заливки і полімеризації біологічних об'єктів, застосування алмазних і скляних ножів при ультратомировании, а також використання высококонтрастирующих сполук для фарбування серійних зрізів вдалося отримати ультратонкі зрізи не тільки великих, а й дрібних вірусів людини, тварин, рослин і бактерій.