Електрофорез

Електрофорез - це процес спрямованого руху часток, диспергованих у рідини в постійному електричному полі. Частинки одного і того ж речовини несуть однакові за знаком заряди. В електричному полі позитивно заряджені частки переміщаються до негативного електрода - катода, негативно заряджені частинки до позитивного електрода - анода. Рух частинок до катода іноді називають катафорезом, до анода - анафорезом. Швидкість руху залежить від маси частинок, і їх заряду в даних умовах, завдяки чому електрофорез дозволяє розділяти суміші речовин на складові їх компоненти.

схема електрофорезу
Рис.1.Схема вільного (фронтального) електрофорезу. Положення границь розділу: а - до досвіду; б - після досвіду. 1 - електроди; 2 - розчинник; 3 - розчин білка.

Розрізняють наступні види електрофорезу. 1. Вільний (фронтальний) електрофорез. У цьому випадку електрофорез проводять в приладах, істотною частиною яких є U-подібна трубка (Рис. 1). Нижню частину трубки заповнюють випробуваним об'єктом, наприклад розчином білка, на який нашаровують розчинник. В розчинник занурюють електроди, з'єднані з джерелом постійного струму. При цьому електрично заряджені частинки білка переміщуються до одного з електродів, внаслідок чого межа розділу між розчином і розчинником в одному коліні піднімається (висхідна кордон), а в іншому опускається (спадна кордон). Прилади для вільного електрофорезу, забезпечені пристроєм автоматичної реєстрації переміщення кожного компонента в досліджуваному об'єкті, застосовують при аналізі дисперсних систем, виділення з них окремих компонентів, а також при клінічному дослідженні сироватки крові.
2. Електрофорез на носіях (зональний електрофорез). В якості носіїв використовують папір, гелі крохмалю, агару, поліуретанів та ін. В клінічних лабораторіях особливо широке поширення для дослідження сироватки крові отримав електрофорез на папері, який проводиться наступним чином: на смужку спеціального сорту паперу, просоченої відповідним буферним розчином (див.), наносять крапельку сироватки крові. Кінці смужки опускають у чашечки, заповнені даними буферним розчином і забезпечені електродами. При пропускання постійного електричного струму окремі білки сироватки переміщуються вздовж смужки з різними швидкостями, а іноді й у різних напрямках. Після закінчення певного часу пропускання струму припиняють, смужку паперу підсушують і обробляють реактивом на білок. При цьому на паперовій електрофореграмі виявляються забарвлені плями. По числу плям судять про кількість білкових фракцій, а по інтенсивності забарвлення плям - про кількісний вміст кожної білкової фракції в досліджуваній сироватці.
Останнім часом широке застосування в дослідницькій роботі і в клінічній діагностиці знаходить електрофорез в тонких шарах гелів, нанесених на скляні пластинки (дисковий електрофорез), а також розміщених у скляні трубочки.
Електрофоретичні дослідження. У клінічній практиці застосовується зональний електрофорез для дослідження білкового складу рідин організму. Частіше використовують електрофорез на папері як найбільш простий за технікою виконання. Електрофорез в агаровом і крохмальному гелі використовується в медичній практиці переважно в наукових дослідженнях.
За допомогою електрофорезу на папері поділяють в крові фракції білків, ліпопротеїдів, глюкопротеидов, а також білкові фракції сечі, шлункового соку, ексудатів і т. п. В крові електрофорез виявляє 5 основних фракцій білка: альбуміни, альфа-1 (α1) альфа-2(α2)-, бета(β)- і гамма(γ)-глобуліни. У нормі їх співвідношення більш або менш постійно. При деяких захворюваннях ці співвідношення змінюються, що може мати діагностичне і прогностичне значення. Так, наприклад, при гострих запальних процесах збільшується вміст в крові α2-глобулінів; в період вироблення імунітету наростає вміст γ-глобулінів; при ураженнях печінки знижується вміст альбумінів і т. п. При деяких захворюваннях (наприклад, при мієломній хворобі) в плазмі крові з'являються патологічні білки (виробляють парапротеиїни), які можуть бути виявлені за допомогою методів електрофорезу, що має велике діагностичне значення.

Електрофорез - явище спрямованого руху ультрамикроскопических і мікроскопічних частинок під впливом прикладеної ззовні різниці потенціалів, що спостерігається в суспензіях, емульсіях, колоїдних розчинах, розчинах високомолекулярних з'єднань (наприклад, білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів і інших).
Електрофорез пояснюється наявністю у мікроскопічних і ультрамикроскопических частинок електричних зарядів, які виникають в результаті вибіркової адсорбції частками іонів з навколишнього дисперсійного середовища або внаслідок дисоціації іоногенних груп, що входять до складу поверхні частинок. Знак електричного заряду частинки залежить як від природи самих частинок, так і від складу дисперсійного середовища. Частинки одного і того ж речовини можуть заряджатися як позитивно, так і негативно при зміні складу дисперсійного середовища. Так, наприклад, макромолекули білка в розчинах, рН яких менше ізоелектричної точки даного білка (див. Амфолиты), заряджені позитивно і переміщуються в електричному полі до негативного полюса - катода, а в розчинах, рН яких більше ізоелектричної точки білка, його макромолекули заряджені негативно і рухаються до позитивного полюса - анода. Рух частинок до катода іноді називають катафорезом, до анода - анафорезом.


Для вивчення електрофорезу застосовують кілька методів.
Найбільш точний фронтальний електрофорез, або метод рухомої межі. Прилади, що застосовуються для фронтального електрофорезу, різноманітні по конструкції, але кожен з них включає электрофоретическую кювету - зазвичай U-образну трубку (рис. 1). Нижню частину трубки заповнюють досліджуваною рідиною, наприклад колоїдним розчином, на який нашаровують розведений розчин електроліту з електропровідністю, рівній електропровідності колоїдного розчину. У відкриті коліна трубки поміщають неполяризующиеся електроди, з'єднані з джерелом постійного струму. При включенні струму колоїдні частинки єдиним фронтом (так як частинки в даному колоїдному розчині мають однакові але знаком електричні заряди) переміщуються до одного з електродів, внаслідок чого межа розділу між колоїдним розчином і розчином електроліту в одному коліні трубки піднімається (висхідна кордон), а в іншому коліні відповідно опускається (спадна кордон). Переміщення границі розділу легко спостерігати, якщо колоїдний розчин забарвлений. Якщо колоїдний розчин безбарвний, кордон розділу між ним і розчином електроліту можна зробити видимою, висвітлюючи апарат збоку; при цьому колоїдний розчин буде опалесцировать. Іноді для цієї мети використовують здатність колоїдних розчинів або розчинів високомолекулярних сполук флюоресцировать під дією ультрафіолетових променів.

Рис. 1. Електрофоретична кювету (схема): 1 - досліджувана рідина; 2 - розведений розчин електроліту; 3 - електроди.

Швидкість U электрофоретического переміщення пов'язана з электрокинетическим потенціалом часток (різниця потенціалів, що встановлюється між кордоном ковзання частинки та дисперсійної середовищем) співвідношенням:
де D - діелектрична проникність дисперсійного середовища, H - падіння потенціалу електричного поля на одиницю довжини, п - 3,14, η - в'язкість дисперсійного середовища і к - постійна, що залежить від форми частинок (для малих сферичних частинок к - З, для циліндричних частинок к-4). Величину U/H, тобто швидкість электрофоретического переміщення частинок, розраховану для падіння потенціалу 1 в/см, називають електрофоретичної рухливістю. Ця величина, що має розмірність см2 в-1 с-1, для білків (поблизу ізоелектричної точки) дорівнює 0,4-0,8·10-4, для еритроцитів різних тварин - 1,0-1,7·10-4 і т. п.
Досконала техніка фронтального електрофорезу складних сумішей білків і інших біополімерів була розроблена в 1937 р. Тизелиусом (A. Tiselius). Прилад Тизелпуса і різні його модифікації, що дають можливість автоматично реєструвати пересування кордону розділу кожного компонента в суміші за допомогою спеціальних оптичних пристроїв та спеціальних діаграм - электрофореграмм (рис. 2), одержали широке поширення для дослідження нормальних і патологічних сироваток, встановлення складу білкових сумішей, визначення чистоти білків.

Рис. 2. Электрофореграммы за Тизелиусу: 1 - нормальна сироватка людини; 2 - плазма крові при множинній мієломі; 3 - сироватка крові при нефрозі.

Зональний електрофорез проводиться в середовищі якого-небудь індиферентний носія, наприклад в гелі агару, крохмалю, желатини, а також на спеціальних сорти фільтрувального паперу. Особливо широке розповсюдження дістав електрофорез на папері (паперовий електрофорез) при дослідженні і розділення білків, нуклеїнових кислот, стеринів, амінокислот, жирних кислот та інших біологічно активних речовин. Електрофорез на папері проводиться при падінні потенціалу близько 15-20 в/см і силі струму 3-5 мА. Досліджувану суміш (зазвичай 0,01-0,04 мл розчину в буфері) наносять у вигляді лінії на середину смужки паперу, кінці якої занурені в електродні розчини, забезпечені неполяризующимися електродами. Після закінчення електрофорезу папір висушують, у разі необхідності обробляють спеціальним реактивом, забарвлюючим окремі компоненти суміші, які утворюють кілька смуг у відповідності з числом компонентів. По інтенсивності забарвлення смуг электрофореграммы можна судити про відносний кількість кожного компонента в суміші.
Мікроскопічний метод електрофорезу полягає у визначенні швидкості пересування в електричному полі видимих у мікроскоп частинок - бактеріальних клітин, еритроцитів, частинок суспензій і емульсій та ін Для микроэлектрофореза застосовують спеціальні микрокюветы, забезпечені електродами.
См. також Иммуноэлектрофорез.