Забарвлення мікроорганізмів

Забарвлення мікроорганізмів - найбільш поширений в мікробіології комплекс методів і прийомів, що застосовується, для виявлення та ідентифікації мікроорганізмів за допомогою мікроскопа. В нативному (природному) стані бактерії мають такий самий коефіцієнт заломлення, як і скло, тому вони невидимі при мікроскопічному дослідженні. Забарвлення мікроорганізмів дозволяє вивчити морфологічні особливості мікробів, а іноді точно визначити їх вид, наприклад деякі мікроби - однакові за морфологією - різному забарвлюються за допомогою одних і тих же складних методів фарбування. Забарвлення мікроорганізмів являє собою фізико-хімічний процес з'єднання хімічних компонентів клітки з фарбою. У ряді випадків різні частини мікробної клітини (ядро, цитоплазма) вибірково фарбуються різними барвниками. Найбільш придатними для фарбування мікроорганізмів є анілінові фарби, головним чином, основні та нейтральні, кислі фарби менш придатні.
Приготування забарвленого препарату включає ряд етапів: 1) приготування мазка; 2) висушування мазка; 3) фіксацію мазка; 4) забарвлення; 5) висушування.
Мазок готують на чистих предметних стеклах, на середину яких наносять невелику краплю води і в неї з допомогою бактеріологічної петлі поміщають досліджуваний матеріал. Матеріал розподіляють на склі рівномірним тонким шаром, розмір мазка-1-2 см2.
Препарат зазвичай висушують при кімнатній температурі на повітрі. Для прискорення висушування допускається підігрівання мазка в струмені теплого повітря високо над полум'ям пальника.
Висушений мазок піддається фіксації, при якій мазок прикріплюється до скла (фіксується), а мікроби стають більш сприйнятливими до фарбування. Способів фіксації багато. Найбільш простий і поширений - фіксація жаром - нагрівання на полум'ї пальника (препарат проводять кілька разів через найбільш гарячу частину полум'я пальника). У ряді випадків вдаються до фіксації рідинами (етиловий або метиловий спирт, ацетон, суміш рівних обсягів спирту та ефіру - за Никифорова). Після фіксації мазок фарбують. Кількість фарби, що наноситься на препарат, має бути таким, щоб покрити всю поверхню мазка. Після закінчення терміну фарбування (2-5 хв.) фарбу зливають і препарат промивають водою.
Існують прості, складні і диференціальні способи фарбування мікробів. При простій фарбуванні зазвичай вживають одну фарбу, частіше всього червоної - фуксин, або синю - метиленовий синій. Фуксин фарбує швидше (1-2 хв), метиленовий синій - повільніше (3-5 хв). Фуксин готують у вигляді концентрованого карболового розчину (фуксин Ціля), дуже стійкого і придатного для фарбування протягом багатьох місяців. Метиленовий синій готується заздалегідь в насиченому спиртовому розчині, який стійок і може довго зберігатися.
Складні способи забарвлення, при яких застосовуються два або більше барвника, є цінними методами, що використовуються в мікробіологічній діагностиці інфекційних хвороб.
Найбільше практичне значення має забарвлення за Грамом (див. Грому метод забарвлення) і забарвлення по Цилю.
Метод фарбування по Цилю є основним для фарбування кислотостійких бактерій. Тут застосовуються два барвника: карболовий фуксин Ціля і метиленовий синій. Кислотостійкі бактерії забарвлюються в червоний колір, все некислотоустойчивые форми - в синій.
Метод Бениньетти є одним із способів фарбування джгутиків. Протрава і забарвлення одним з фарбувальних розчинів, що складаються ex tempore (за мірою потреби): I - сульфат цинку - 1 г, танін - 10 г, дистильована вода - 100 мл і ІІ - насичений спиртовий розчин генціанвіолета. Змішують 5 мл розчину I і 3 мл розчину II, наносять на препарат, нагрівають до появи парів, промивають водою, висушують і розглядають.
З інших складних методів застосовується так званий негативний спосіб Буррі (див. метод Буррі), спосіб Гінса для виявлення капсул (див. Гінса метод) і ряд інших. См. також Бактеріологічне дослідження.


Забарвлення мікроорганізмів - комплекс методів вивчення структури і морфології мікроорганізмів при мікроскопії препаратів, приготовлених з чистих культур або досліджуваного матеріалу. Забарвлення мікроорганізмів - важливий діагностичний прийом, що дозволяє встановити морфологічні особливості мікроба, а також розрізнити морфологічно ідентичні мікроорганізми, які по-різному фарбуються при використанні одних і тих же методів забарвлення.
Забарвлення мікроорганізмів - складний фізико-хімічний процес, механізм якого в деталях ще не вивчений. В основі забарвлення мікроорганізмів лежить взаємодія окремих структур бактерії з барвником. Отже, результат О. м. залежить від хімічної та фізичної будови мікробів, властивостей барвника, способу приготування препарату та методу обробки їм мікроба. Для О. м. використовують основні, кислі і нейтральні барвники. В основних барвників забарвлюючим початком служить катіон, а аніон безбарвний; у кислих, навпаки, фарбувальна частина молекули є аніоном. Утворюються при дисоціації основних барвників катіони з'єднуються зі структурами бактерій, що володіють кислими властивостями; вивільнювані аніони кислих барвників з'єднуються зі структурами мікроорганізму, що мають основні властивості.
В звичайних середовищах бактерії мають негативний поверхневий заряд, в їх цитоплазмі та ядрі є з'єднання кислої природи. Тому основні барвники, у яких фарбувальна частина молекули заряджена позитивно, володіють великим спорідненістю до бактерії і найчастіше застосовуються в мікробіології, ніж кислі барвники, які зазвичай використовуються для контрастного забарвлення фону препарату. У нейтральних барвників фарбувальними є і катіони і аніони (фарба Романовського - Гимзы).
Фіксовані бактерії забарвлюються краще живих, так як клітинна стінка і цитоплазматична мембрана живої клітини обмежують проникнення в неї барвника. Для вітальної забарвлення мікроорганізмів (забарвлення живих мікроорганізмів) барвники застосовують у великих розведеннях (1:10 000 - 1:100 000), щоб уникнути артефактів, що з'являються в результаті токсичної дії барвника на живі мікроорганізми. Найчастіше для вітальної О. м. користуються метиленовим сипим, нейтральним червоним та ін Препарати для мікроскопії готують методом роздавленої краплі. (див.) або висячої краплі (див.).
Найбільш поширені методи О. м. у фіксованих препаратах. Ці методи поділяють на прості і складні. При простих методах застосовують один барвник (наприклад, забарвлення метиленовим синім, фуксином Пфейфера та ін). При складних методах застосовують кілька барвників і дослідження включає кілька етапів фізичної і хімічної обробки препарату (див. Грама метод фарбування, фарбування по Цилю - Нельсену - див. Туберкульоз; забарвлення. Романовському - Гімзе - див. Кров та ін). Складні методи фарбування мікроорганізмів використовують мікробіологічної діагностики для вивчення будови і функцій мікроорганізмів. Наприклад, за допомогою забарвлення за Грамом диференціюють грампозитивні мікроби від грамнегативних, що має велике значення для ідентифікації гонококів, менінгококів, кишкових бактерій та ін. Методом Ціля - Нельсена; користуються для діагностики туберкульозу і прокази, методом Ненесера - дифтерії.
В якості прикладу використання забарвлення мікроорганізмів для вивчення будови і функцій мікроорганізмів можна вказати на застосування йоду для виявлення крохмалю, вікторії синій - для виборчої забарвлення клітинної стінки і цитоплазматиической мембрани бактерій, осмієвої кислоти - для фарбування жиру і т. д. Ці методи засновані на відмінності в хімічному будову окремих морфологічних структур мікроба, вибірково офарблюються різними барвниками.
Інші методи забарвлення окремих структур мікроорганізмів засновані на здатності цих структур по-різному фіксувати барвники, що виявляється при подальшій обробці препарату спиртом, кислотою, ацетоном та ін. і докрашивании контрастним барвником. Так, для виявлення суперечка використовують їхню властивість міцно фіксувати барвник і не знебарвлюватися при подальшій обробці кислотою. При фарбуванні бактерій за Грамом основними барвниками (генциановый фіолетовий та ін) з подальшою обробкою йодом в одних мікроорганізмів (грампозитивні) барвник міцно фіксується і не видаляється при обробці спиртом або ацетоном; грамнегативні ж бактерії легко знебарвлюються. Для виявлення в бактеріях нуклеоида застосовують метод Фейльгена. Від забарвлення у власному сенсі слід відрізняти импрегнацию солями металів, наприклад импрегнацию солями срібла при фарбуванні спірохет за методом Левадити (див. Сифіліс).
Крім позитивних методів забарвлення (барвник безпосередньо діє на фарбований субстрат), в мікробіології використовують і негативні методи - фарбування фону препарату. Вони застосовуються у разі, коли мікроби або їх окремі структури погано фарбуються. Класичним прикладом негативної забарвлення є метод Буррі (див.). У тих випадках, коли необхідно виявити у мікроорганізму капсулу і пофарбувати сам мікроб, негативні і позитивні методи комбінують (див. Гінса метод).
Існує також кілька способів підвищення ефективності забарвлення. Одні з них створюють умови для проникнення барвника всередину пофарбованого об'єкту (наприклад, при фарбуванні спір препарати попередньо обробляють соляною кислотою). Інші методи, пов'язані із застосуванням протрав, призводять до збільшення забарвлюється об'єкта [наприклад, застосування солей таниновой кислоти для фарбування джгутиків у бактерій (див. Бениньетти метод), телець Пашена - за методом Морозова та клітинної стінки - за методом Нейзи].
См. також Бактеріологічна техніка, Бактеріологічне дослідження.