Поживні середовища

Поживні середовища - субстрати, які використовуються для культивування в штучних умовах різних мікроорганізмів. Поживні середовища широко застосовують у повсякденному мікробіологічній практиці для постановки лабораторного діагнозу інфекційних захворювань, для виділення мікробів з різних предметів зовнішнього середовища з метою з'ясування джерел зараження, а також при епідеміологічному обстеженні людей і тварин для з'ясування носійства збудників інфекційних захворювань. П. с. застосовують також для отримання мікробних мас, що використовуються при приготуванні вакцин і діагностичних антигенів, у виробництві антибіотиків та ін.
Живильне середовище, призначена для культивування мікробів, повинна мати оптимальні умови для їх росту і розмноження. З цією метою при створенні П. с. передбачають наявність в них сполук, які є джерелами азоту, вуглецю і водню, набір необхідних іонів у вигляді неорганічних солей. У ряді випадків у середу додають так звані фактори росту, тобто сполуки, які не синтезуються культивованим мікробом (див. Бактеріальні фактори росту). Але наявність у П. с. всіх зазначених компонентів ще не може забезпечити оптимальні умови для росту і розмноження мікробів, так як ці процеси залежать також від фізико-хімічних властивостей середовища. До них відносяться: рН, окислювально-відновний потенціал, в'язкість, вологість і осмотичні властивості.
Якщо П. с. відповідає біологічним особливостям мікроба і забезпечує його зростання і розмноження, то її називають оптимальною або повноцінним, якщо в ній не вистачає якогось компонента, необхідного для росту і розмноження мікроба, таке середовище характеризують як дефіцитну. Так як різні види бактерій і навіть штами, що відносяться до одного виду можуть значно відрізнятися один від одного по фізіології і характером обміну речовин, то, природно, що для їх вирощування використовують різні поживні середовища.
Джерелом вуглецю в П. с. служать вуглеводи, спирти і деякі органічні кислоти, джерелом азоту - мінеральні або органічні сполуки. Дуже широко використовують пептони - продукти ферментативного або кислотного гідролізу білків різного походження і являють собою суміш амінокислот та поліпептидів різної складності. Відмінності в амінокислотному і пептидном складі пептонів залежать від властивостей вихідного білка і ступеня його розщеплення. Поживна цінність пептона визначається його амінокислотним і пептидным складом.
Сировиною для виготовлення пептонів служать білки м'яса, риби, дріжджів, казеїн і ін Поряд з пептонами як джерелами азоту в мікробіологічній практиці застосовують також м'ясну воду, яку для вирощування ряду бактерій частіше готують з м'яса тварин. Для приготування м'ясної води м'ясо звільняють від кісток, сухожиль і жиру і перемелюють на м'ясорубці. Отриманий фарш заливають холодною водопровідною водою (на 1 ч. фаршу 2 ч. води), добре розмішують і залишають на добу в прохолодному місці. М'ясний настій фільтрують через кілька шарів марлі кип'ятять і знову фільтрують через паперовий фільтр, а потім доливають водою до початкового об'єму.
У пептонах, м'ясному настої або тканинних екстрактах, крім органічного азоту, що містяться бактеріальні фактори росту, і тому середовища, приготовані на їх основі з додаванням солі (NaCl), придатні для культивування багатьох мікроорганізмів. Однак для вирощування ряду патогенних мікробів (дифтерійна паличка, збудник коклюшу, бруцел та ін) мясопептонная живильне середовище непридатна, і тому в цих випадках використовують спеціальні середовища, наприклад яєчні середовища з сироватками, кров'ю тощо
В залежності від властивостей, складу і призначення П. с. ділять на групи. За консистенцією розрізняють тверді поживні середовища, напіврідкі і рідкі. Прикладом твердих середовищ є 1,5-2% агаровые середовища (м'ясо-пептонний агар, агар Хоттингера), поживна желатину, згорнута сироватка, згорнутий яєчний білок, картопля та ін Для приготування твердих П. с. найбільш часто використовують агар-агар, що отримується з морських водоростей. Агар-агар є речовиною полісахаридної природи. У воді набухає, утворюючи холодець. Розріджується при t° 70-100° і застигає при 40-50°.
Напіврідкої середовищем є 0,5% агар, м'ясо-пептонний (див.).
До рідких середовищ відносять бульйон м'ясо-пептонний (див.), пептонную воду цукровий бульйон, бульйон Хоттингера, що представляє собою розведений (в 4-9 разів) м'ясної фільтрат, що піддався ферментативному гідролізу панкреатин містить 0,5-1% кухонної солі.


Поживні середовища бувають прості і складні. Простими середовищами є пептонная вода, м'ясо-пептонний бульйон, м'ясо-пептонний агар, поживна желатину. На основі простих середовищ готують складні (м'ясо-пептонний цукровий бульйон, кров'яний агар, асцит-агар та ін). Складність тієї чи іншої живильного середовища залежить від біологічних особливостей вирощуваної мікроба, а також від цілей дослідження. Так, наприклад, для вирощування гемоглобинофильных бактерій використовують складну середовище Борде - Жангу, в якій дефибринированную кров людини або кролика додають до картопляно-глицериновому бульйону або аґару. Багато складні живильні середовища використовують для виявлення у культивованого мікроба специфічних властивостей, що виражаються в морфології колоній, характер росту або в особливостях обміну речовин. П. с., які дозволяють встановити специфіку мікроба, називають диференціально-діагностичними (див. Диференційно-діагностичні середовища). Наприклад, для виявлення здатності бактерій розщеплювати глюкозу з виділенням ацетил-метил-карбінол (реакція Фогеса - Проскауэра) використовують середу Кларка, в якій містяться пептон, глюкоза, ДО2НРО4 і лугу (КОН). Ацетил-метил-карбінол у присутності лугу і кисню окислюється в діацетил, а останній, з'єднуючись з гуанидином, що знаходяться в пептоне, дає червоне забарвлення.
Особливу групу складають селективні середовища, при яких створюються найкращі умови для вирощування певного виду мікробів і несприятливі для інших видів, наприклад середовища Мюллера, Кауфмана, Лифсона, Шустовой для виділення кишкових бактерій, лужний агар - селективна середовище для холерного і холероподобных вібріонів, середовища з додаванням антибіотиків дають можливість селекціонувати антибиотикорезистентных від чутливих бактерій. З перерахованих середовищ широке поширення має середовище Кауфмана, використовувана в якості збагачувальної середовища для бактерій групи сальмонел і черевного тифу. Основними інгредієнтами середовища є гипосульфитный бульйон, бриллиантгрюн і жовч. Селективність для анаеробних мікроорганізмів створюється шляхом зниження в середовищі концентрації розчиненого кисню. Однією з поширених поживних середовищ, які використовуються для вирощування анаеробів, є середовище володіє нескінченним набором знань - Тароцци, в якій роль адсорбенту кисню і редуцирующего фактора виконують знаходяться в середовищі шматочки печінки тварин.
До складних П. с. відносять також синтетичні (див. Синтетичні живильні середовища). Своєрідність середовищ цієї групи виражається в тому, що всі їх компоненти є хімічно чистими сполуками, на відміну від раніше згадуваних середовищ, що містять в якості поживних субстратів продукти природного походження (пептони, кров, асцитичної рідина тощо). Мінімальні синтетичні живильні середовища містять набір солей, а джерелом енергії служить глюкоза або молочна кислота, джерелом азоту - амонійні солі. Такі середовища придатні для вирощування прототрофных мікробів. Ауксотрофные мікроби, не здатні синтезувати будь-які життєво важливих сполук (амінокислоту, вітаміни, пуриновое або пиримидиновое підстава), культивують на середовищах, що містять, крім набору солей, той чи інший додатковий інгредієнт, за яким даний мікроб ауксотрофен. Наприклад, якщо культивуються бактерії не здатні синтезувати триптофан або іншу амінокислоту, то до сольовий мінімальної середовищі додають відповідну амінокислоту. Зазвичай 1-амінокислоти вносять у концентрації 20 мкг/мл, а dl-амінокислоти - 50 мкг/мл Синтетичні П. с. використовують для вивчення фізіології бактерій, зокрема обміну речовин, і особливо при вивченні деяких проблем біохімічної генетики. Синтетичні П. с. застосовують і в селекції мікробів для відбору ауксотрофных або прототрофных штамів.
В лабораторних умовах для приготування, зберігання і розливу поживних середовищ використовують бактеріальні пробірки, плоскодонні колби, флакони тощо
Для пластинчастих твердих середовищ застосовують чашки Петрі. У масовому мікробіологічному виробництві бактеріальні культури вирощують в металевих котлах (реактори) великої ємності (500-1000 л).
У посуді, що використовується для П. c., не можна зберігати дезинфікуючі речовини, антибіотики, так як найменші їхні сліди роблять середовище непридатною для вирощування мікробів. Перед вживанням посуд ретельно миють і висушують. Новий посуд попередньо кип'ятять в 1 % розчині соляної кислоти і промивають в проточній дистильованій воді. Поживні середовища зазвичай повинні бути прозорими, тому їх до вживання фільтрують або відстоюють. Відстояні розплавлені агаровые середовища фільтрують через ватно-марлевий фільтр (при фільтруванні через вату якість середовища може знизитися за рахунок адсорбції на ній сполук середовища, стимулюючих зростання мікроба). Рідкі середовища фільтрують через фільтрувальний папір або полотно. Якщо агар після фільтрування або відстоювання залишається каламутним, його освітлюють, додаючи яєчний білок або сироватку з розрахунку на 1 л середовища одне куряче яйце або 20-25 мл сироватки. Додані білки згортаються, адсорбують зважені частинки і, осідаючи, прояснюють середу. Готові поживні середовища розливають у відповідну стерильну посуд і стерилізують.
Стерилізація (див.) - дуже відповідальний етап приготування П. с. Режим її не повинен змінювати властивості середовищ. Найбільш поширена й ефективна стерилізація за допомогою високої температури в автоклавах (див.) під тиском або текучим паром. Зазвичай П. с. стерилізують в автоклаві при 1 атм. (120,6°) протягом 15-30 хв., в окремих випадках і при обсягах середовища, що перевищують 1 л, - протягом 1-1,5 год. Зазначеним способом користуються для стерилізації середовищ, що не містять вуглеводи і нативні білки або інші термолабільні субстанції. При наявності в середовищі термолабільних субстанцій користуються бактеріальними фільтрами або дробової стерилізацією. При стерилізації бульйонних середовищ або середовищ, що містять інші органічні джерела живлення, можлива зміна рН в кислу сторону на 0,1-0,2.
Готові поживні середовища зберігають у холодному і темному приміщенні з достатньою вологістю. Довгостроково зберігати П. с. небажано: щільні середовища підсихають, а в рідких можливе випадання опадів.
Для стандартизації умов культивування мікробів і полегшення лабораторних робіт застосовують сухі П. с. - гігроскопічні порошки, що розчиняються у воді. Перед вживанням такі П. с. розчиняють у дистильованій воді і потім стерилізують.