Більшість джерел світла, що існують у природі, є температурними.
Багато речовини, нагріті до певної температури, випромінюють світло. Люмінесценція - особливий вид світіння речовини, яка за рідкісним винятком не супроводжується підвищенням його температури.
Існує кілька видів люмінесценції, що класифікуються в залежності від методу збудження молекул речовини.
Фотолюмінесценція - світіння речовини, що викликається променистої енергії, падаючої на люминесцирующее тіло.
Хемілюмінесценція - світіння, що викликається енергією, що утворюється при хімічній реакції.
Електролюмінесценція виникає під дією електричного розряду. Найчастіше спостерігається при проходженні електричного струму через розріджений газ.
Рентгенолюминесценция - світіння, що виникає під дією рентгенівських променів.
Катодолюмінісценція - світіння речовини, що знаходиться під впливом потоку електронів.
Триболюминесценция - люмінесценція, що викликається тертям.
Люмінесценцію поділяють ще по тривалості світіння - на флуоресценцію і фосфоресценцию.
Флуоресценція - це світіння, що виникає миттєво, в момент збудження молекул речовини. З видаленням джерела збудження світіння припиняється.
Фосфоресценція - тривале світіння тіл, що акумулюють енергію і випускають світіння тривалий час і після видалення джерела збудження.
Фізичний зміст явища флуоресценції полягає в наступному. При поглинанні ультрафіолетового променистої енергії молекули речовини переходять в «збуджений» стан, при якому електрони знаходяться на більш високих енергетичних рівнях. Збуджена молекула не може довго зберігати надлишок енергії і повертається в нормальний стан шляхом випромінювання надлишку енергії у вигляді перетвореної променистої енергії - флуоресценції.
Як правило, спектр флуоресценції зміщений у порівнянні зі спектром поглинання збуджуючого світла в бік більш довгих хвиль (правило Стокса) [8], що пов'язано з перерозподілом енергетичних рівнів молекул і зменшенням енергії кванта, випромінюваного речовиною, порівняно з квантом поглинутого світла.
Існує кілька видів люмінесцентного аналізу: люминометрический кількісний аналіз (флуориметрія), сортовий і якісний аналіз, люмінесцентна мікроскопія, флуориметрическое титрування із застосуванням флуоресцентних індикаторів, люмінесцентна хроматографія та ін.
В аналітичній практиці кількісного аналізу найбільш широке застосування отримала фотолюмінесценція (флуориметрія), що проявляється здебільшого в ультрафіолетовому світлі. Цей вид аналізу заснований на залежності, у певних умовах, що між інтенсивністю люмінесценції і концентрацією аналізованого речовини [30].
Отримання правильних результатів зумовлене обов'язковим урахуванням ряду заважаючих факторів, які є специфічними для цього виду аналізу. Чутливість флуориметричних видів аналізу значно вище абсорбциометрических і часто вплив мікродомішок в реактивах сильно спотворює результати дослідження. Ця висока чутливість викликає необхідність застосування реактивів особливої чистоти або хімічно чистих.
Флуоресцентний аналіз використовується для виявлення і ідентифікації речовин. Основою для цього дослідження є правило, згідно з яким спектр флуоресценції є характерним для даної речовини і не залежить від довжини хвилі збуджуючого світла. Таким чином, випромінювання має завжди однаковий спектральний склад за дуже рідкісним винятком. Це властивість використовується в тих випадках, коли потрібно встановити наявність шуканого речовини, вивчити хімічні зміни, претерпеваемые цією речовиною, а також визначити його кількість.
Переваги люмінесцентного аналізу в порівнянні з іншими методами аналізу не обмежуються високою чутливістю, що дозволяє виявляти стомиллиардные частки грама вихідної речовини [35]. Цей вид аналізу відносно простий, дозволяє достатньо швидко отримувати результати, внаслідок чого він може бути зарахований до експресним видів аналізу.
Є ряд факторів і закономірностей, що впливають на флуоресценцію речовин у розчині [30]. Встановлено, що залежність інтенсивності флуоресценції розчину від концентрації що флуоресціює речовини має межу. Це відбувається внаслідок «гасіння» флуоресценції молекулами самого що флуоресціює речовини, що настає у більшості флуоресціюючих речовин уже в концентрації 10-4 г/мл і вище.
При збільшенні концентрації вище цих меж інтенсивність світіння не тільки повільно зростає, але навіть може знижуватися. Тому слід працювати з розчинами більш низької концентрації що флуоресціює речовини, близько 10-6÷10-7 г/мл і нижче.
Відомо, що гранична концентрація, до значення якої зберігається пропорційність флуоресценції, для різних речовин різна. Тому необхідно попереднє побудова калібрувальної кривої по стандартних розчинів. Таким шляхом для кожної речовини експериментально визначається область концентрацій, придатних для вимірювання.
Важливим фактором, що впливає на інтенсивність флуоресценції, є рН розчинів. При цьому може змінюватися не тільки інтенсивність флуоресценції, але і її колір (спектр). Наприклад, розчин акридину однакової концентрації, в кислому середовищі дає зелену флуоресценцію, в лужному - лілове, що пов'язано з тим, що в кислому середовищі флуоресціює іон акридину, а в лужному - недиссоциированное основу. Таким чином, речовини, молекули яких здатні по-різному дисоціювати в кислих і лужних середовищах, повинні досліджуватися і однаковою при певній концентрації водневих іонів.
Зниження флуоресценції або «гасіння» може обумовлюватися не тільки молекулами що флуоресціює речовини, але і іншими неорганічними або органічними компонентами, наприклад йодистого калію, хромистого натрію і ін.
Однією з закономірностей люмінесценції, встановленої С. В. Вавіловим, є залежність енергетичного виходу люмінесценції від довжини хвилі збуджуючого світла, так званий квантовий вихід, який являє собою відношення випромінюваної речовиною енергії люмінесценції до поглинутої енергії збудження [30].
Квантовий вихід зберігається постійним аж до деякого значення, характерного для кожної речовини, після чого різко падає. Відповідно до цієї закономірності спектр люмінесценції не залежить від довжини хвилі збуджуючого світла.
Квантовий вихід має значення при оцінці чутливості аналізу і при знятті характеристичних спектрів речовини.
При роботі з флуометрами необхідно враховувати наступне:
1. Для речовин, молекули яких дисоціюють по-різному в різних середовищах, потрібно дотримувати однакову величину рН у досліджуваних і стандартних розчинах.
2. При дослідженнях необхідно проявляти Певну ретельність, так як на посуді або на руках можуть виявитися сліди флуоресціюючих речовин, які при попаданні в розчин можуть спотворити його флуоресценцію. Деякі миючі засоби володіють значною флуоресценцією і не віддаляються при обполіскуванні.
3. При користуванні газорозрядними лампами потрібно дотримуватися необхідні заходи. Колби ламп високого і надвисокого тиску нагріваються до 700° С. Тому лампи цього типу поміщені в арматуру і їх слід установлювати, як зазначено в інструкції. Для повітряного охолодження лампи є вентиляційні отвори і під час роботи лампу не слід знімати і відкривати. Повторне запалювання лампи після виключення можливе лише після її охолодження.
Прилади для флуоресцентного аналізу містять наступні основні елементи або вузли:
а) джерело ультрафіолетового випромінювання для збудження флуоресценції;
б) первинні світлофільтри або монохроматор для виділення монохроматичного ділянки спектру збудження;
в) кювети;
г) вторинні світлофільтри для виділення флуоресценції;
д) приймач випромінювання (з підсилювальним пристроєм) і вимірювальний прилад.
Найбільш широке застосування в якості джерела ультрафіолетового випромінювання отримали ртутно-кварцові лампи. При певній напрузі, доданому до електродів лампи, виникає електричний розряд у парах ртуті. Розрізняють ртутні лампи низького, високого та надвисокого тиску. Застосовуються також ртутно-кварцові лампи газового дугового розряду типу ДРШ, що володіють великими густиною випромінювання, газонаповнені імпульсні лампи, ксенонові лампи високого тиску.
Ртутно-кварцові лампи надвисокого тиску є концентрованими джерелами ультрафіолетового світла. Така лампа з повітряним охолодженням, наприклад СВД-120А, дає високу яскравість випромінювання на невеликій ділянці. Лампа споживає потужність 120 Вт. Всередині кварцової трубки знаходяться пари ртуті, які при роботі лампи створюють тиск близько 50 атм. Цей тип лампи широко застосовується у вітчизняних приладах.
Ксенонові лампи високого тиску випромінюють безперервний спектр широкого діапазону і високої інтенсивності. Ці лампи придатні як для приладів кількісного аналізу, тобто для оцінки інтенсивності флуоресценції, так і для зняття спектрів збудження.
Оскільки інтенсивність флуоресценції залежить від інтенсивності збуджуючого світла, то збільшення чутливості приладу пов'язане з використанням джерел світла великий яскравості. Однак багато флуоресціюючі речовини, особливо в сильно розбавленому вигляді, піддаючись сильному опроміненню, поглинають його і при цьому руйнуються, що спотворює результати дослідження. Має місце так зване фоторазрушение. Щоб уникнути цього, у багатьох приладах утримуються від застосування сильних джерел світла, вважаючи за краще підвищувати чутливість приладу за рахунок збільшення чутливості приймачів світла. Для цієї ж мети, тобто зменшення фоторазрушении, в приладах встановлюються шторки для відкривання джерела світла тільки на час вимірювання.
Для виділення певних ділянок ультрафіолетового випромінювання застосовуються світлофільтри як з кольорового оптичного скла, так і інтерференційні. Зазвичай для люмінесцентного аналізу використовуються наступні марки: УФС-1 (область 240-400 нм); УФС-2 (область 270-380 нм); УФС-6 (область 320-390 нм).
В якості виборчих фільтрів з кольорового скла застосовуються також ФС-1, ФС-6 (фіолетові), СС4, СС5, СС8, СС14 (сині) і синьо-зелені (СЗС5, СЗС7, СЗС8 та ін).
Замикаючі або загороджувальні світлофільтри повинні, навпаки, не пропускати, а поглинати небажану область випромінювання. Вони служать для гасіння збуджуючого світла при вимірюванні флуоресценції. Так, наприклад, для гасіння ультрафіолетового світла застосовуються світлофільтри з жовтого скла ЖС-4, ЖС-11 і ін [16].
У багатьох випадках необхідні інтерференційні світлофільтри, які дозволяють виділяти більш вузькі ділянки спектру збудження. В останні роки такі фільтри все частіше використовуються при конструюванні флуориметров.
Кращими пристроями для виділення вузьких спектральних інтервалів є монохроматоры. Монохроматоры можуть застосовуватися для виділення ділянок спектрів збудження та флуоресценції. Монохроматоры складні та відносно дороги, щоб їх можна було застосовувати замість фільтрів. Їх використовують головним чином при конструюванні складних приладів, спектрофлуориметров і спектрофотометрів. В якості приймача випромінювання у флуориметрах застосовуються головним чином фотоелектронні помножувачі (ФЕП). Коефіцієнт підсилення цих електровакуумних приладів досягає від 105 до 107. Особливо важливо таке посилення у випадках, коли мають справу з дуже слабкими випромінюваннями.
У фотопомножувачах застосовуються такі ж фотокатоди, як і в фотоелементах і, таким чином, все сказане про фотокатодах залишається в силі і для ФЕУ [30].
Принцип дії ФЕУ і схема включення показано на рис. 81. У фотоумножителе є фотокатод, ряд каскадів підсилення (динодов), до кожного з яких додано прискорює напруга і анод.
Рис. 81. Схема включення фотопомножувача.
К - фотокатод; Д1,2,3 - диноды; G - мікроамперметр; R - ділянки дільника напруги.
Світловий потік потрапляє на фотокатод До через скло балона або через кварцове вікно. Кванти світла вибивають з фотокатода електрони, які рухаються під дією прикладеної напруги на перший каскад підсилення (динод) Д. Кожен електрон вибиває з динода кілька нових електронів. Знову утворилися електрони прямують до наступного диноду Д, де число електронів знову зростає в кілька разів, і так до останнього динода. Весь помножений потік електронів потрапляє на анод, і таким чином ланцюг замикається і по ній починає протікати струм, який реєструється микроамперметром G. Зазвичай число динодов, що містяться в ФЕУ, становить від 8 до 14. R - ділянки дільника напруги.
Найважливішими параметрами ФЕУ є: чутливість фотокатода, спектральна чутливість, довговічність, анодна чутливість, темновий струм, поріг чутливості, лінійність.
Для виміру флуоресценції в приладах застосовуються три основних види оптичних схем: 1) для виміру флуоресценції в прохідному світлі, 2) для вимірювання флуоресценції під кутом 90°, 3) для виміру флуоресценції з поверхні збудження.
На рис. 82 зображена спрощена оптична схема для вимірювання флуоресценції в минаючому світлі. Світло джерела випромінювання 1 проходить первинний світлофільтр 2, який виділяє монохроматичне світло для збудження флуоресценції. Це монохроматичне випромінювання падає на кювету 5 з розчином. Виникає в розчині випромінювання флуоресценції проходить через вторинний світлофільтр 3, надходить на фотоприймач 4 і реєструється микроамперметром. Перша схема застосовується в тих випадках, коли в приладі використовуються досить довгі кювети. При цьому практично всі збуджуюче випромінювання поглинається в кюветі. Недолік цієї схеми проявляється в тому, що в певних умовах (довжина кювети, поглинаючі властивості розчину) флуоресценція може поглинатися або послаблюватися в самій кюветі.
Рис. 82. Оптична схема для вимірювання флуоресценції в минаючому світлі.
Пояснення в тексті.
Рис. 83. Оптична схема для вимірювання флуоресценції під кутом 90°.
1 - джерело випромінювання; 2 - первинний світлофільтр; 3 - кювета з розчином; 4 - вторинний світлофільтр; 5 - фотоприймач.
Для усунення цього недоліку застосовується схема вимірювання флуоресценції під кутом 90° до осі збуджуючого випромінювання. Схема показана на рис. 83, а я б.
Переваги вимірювання під кутом 90° наступні:
а) кювета може бути значно коротшим і меншої ємності;
б) вторинний світлофільтр можна ставити з меншою вибірковістю;
в) для збудження флуоресценції може бути використаний більш широкий спектр, що веде до збільшення чутливості всієї системи.
Третій варіант оптичної схеми застосовується при конструюванні приладів, призначених для вимірювання флуоресценції розчинів, сильно поглинають випромінювання.
На рис. 84 зображено принципова оптична схема для вимірювання флуоресценції з поверхні збудження. Світло джерела збудження 1 проходить, первинний світлофільтр 2, напівпрозоре дзеркало 3 і падає на кювету. Флуоресценція розчину з тієї ж сторони кювети потрапляє на дзеркало, відбивається і надходить через вторинний світлофільтр 4 на фотоприймач 5.
У цьому варіанті оптичної схеми товщина шару розчину може бути зменшена порівняно з попередніми.
Рис. 84. Оптична схема для вимірювання флуоресценції з поверхні збудження. Пояснення в тексті.
