Визначення преципітуючих антитіл проводять методом подвійної дифузії в гелі [Ouchterlony, 78]. Антиген (зняте молоко або його очищені білкові фракції) поміщають в центральну лунку, а досліджувану на антитіла сироватку - в периферичні лунки. По мірі дифузії в гелі антиген і антитіло взаємодіють один з одним, утворюючи комплекси, які з'являються у вигляді ліній преципітації; кожна лінія - для одного антигену і відповідного йому антитіла. Лінії преципітації аналізують візуально (рис. 10). Хоча метод відносно простий, для правильного трактування даних він вимагає великого досвіду роботи. Зіставні результати можна отримати лише при ретельній стандартизації всіх умов вимірювань, таких, як відсоток і кількість використаної агарози, відстань між лунками, час інкубації, що використовуються позитивні та негативні контрольні сироватки та ін. Мінімальна визначувана концентрація антитіл IgG або IgA класів становить приблизно 50 мкг/мл, а антитіл класу IgM - 200 мкг/мл
Рис. 10.
Множинні лінії преципітації між білками сирого знятого коров'ячого молока в розведенні 1 : 10 (центральна лунка) і антитілами сироватки крові хворого з хронічним захворюванням легенів, викликаних прийомом молока (лунка 3). В лунках 2 і 4 нанесені сироватки крові 2 хворих з іншими проявами алергії. Лунки 5 і 6 містять сироватки крові здорових людей без проявів алергії, а лунка 7 - ізотонічний розчин хлориду натрію.
Рис. 11. Микрослайдовая методика подвійної дифузії в агарі з використанням резервуарів з плексигласу.
Чутливість методу зростає в 10-20 разів при використанні плексигласових пластинок, які дозволяють досліджувати великі кількості антигенів в тонкому шарі агару (рис. 11) [79, 80]. Слід, однак, враховувати, що білки сорбуються на стінках пластинок, і, якщо після кожного аналізу їх ретельно не видалити або не зіскоблити, наступні визначення можуть дати хибно-негативний результат.
Згідно з даними обстеження дітей з шлунково-кишковими кровотечами, обумовленими прийомом молока, антимолочные преципитины були виявлені у 62% випадків; невыборочное обстеження виявило наявність цих антитіл лише в 1-2% випадків. Високий титр преципитинов або множинні смуги преципітації не характерні для здорових людей [81, 82], і їх не часто виявляють у дорослих з алергією до молока [83, 84]. Разом з тим сироваткові преципитины до білків коров'ячого молока виявляються в значному числі випадків при обстеженні дітей, що страждають хронічним захворюванням легенів невідомої етіології [11, 74]. При цьому, якщо дітей, у сироватці крові яких виявлені преципитины, переводили на безмолочну дієту, їх стан в значному відсотку випадків суттєво покращувався. Цей окремий випадок використання методів преципітації в агарі виявився, як показує багаторічний досвід, досить ефективним. Тим не менш широке використання методів преципітації для обстеження дітей з алергією або навіть осіб з підозрою на викликану молоком алергію виявилося недоцільним, за винятком випадків, коли симптоми хвороби вкладалися в картину легеневого захворювання або порушення всмоктування.
При переході на безмолочну дієту титр преципитинов знижується, як правило, через 2-4 міс і може знову зрости до вихідного рівня після прийому молока [47, 85].
Титр антимолочных преципитинов підвищений у сироватці крові хворих при наступних захворюваннях: ентеритах типу спру, інших формах хронічної діареї, залізодефіцитної анемії, кістозному фіброзі [8], недостатності IgA [86-88], синдромі Дауна [43, 87, 89], сімейної вегетативної дисфункції [90, 91], синдромі Віськотта - Олдріча, синдромі Гурлера і хронічній рецидивуючій пневмонії [92]. Значення антимолочных преципитинов при більшості перерахованих захворювань залишається мало зрозумілим.
При аналізі великих серій сироваток, що містять антимолочные преципитины, і порівняння останніх з контрольними лініями преципітації для 10 специфічних білків коров'ячого молока було встановлено, що в сироватці крові, як правило, містяться преципитины проти термолабільних білків, кількість яких у молоці незначно [93]. Ці дані виявилися певною мірою несподіваними, так як термостабільні білкові фракції, особливо бета-лактоглобулін і казеїн, містяться в молоці в значно більших кількостях. Крім того, саме термостабільні білки вважаються більш сильними алергенами у хворих з порушеннями процесу всмоктування в кишечнику і діареєю, викликаними вживанням молока.
