Фотометричні і спектрофотометрические методи отримали широке поширення в лабораторіях. Ці методи дозволяють відносно швидко визначати дуже малі кількості речовин. Відрізняючись простотою, гарною чутливістю і високою швидкістю аналізу, вони знаходять застосування як у повсякденній практиці, так і в дослідницькій роботі. Фотометричний аналіз є одним з найбільш зручних методів визначення малих кількостей речовини, так як існує практично необмежена можливість перетворення речовини в розчин, сильно поглинає світло [3].
Є певна закономірність у поглинанні частини світлового спектру забарвленим розчином. Наприклад, розчин, пофарбований у жовтий колір, поглинає синю частину світла, тобто додатковий колір.
Величина світлопоглинання в фотометрії виражається величиною оптичної густини D (екстинкції або поглинання розчину іноді позначається Е). Величина, зворотна щільності, називається прозорістю, або пропусканням розчину, позначається Т і виражається у відсотках.
Основним законом колориметрії і абсорбціометріі є об'єднаний закон Вугера - Ламберта - Віра. З цього закону випливає, що оптична щільність розчину, або екстинкції, прямо пропорційна концентрації поглинаючої речовини, товщині шару розчину і молярному коефіцієнту погашення. Закон має наступний вираз
D = Е = ελСl, де D - щільність або Е - екстинкції;
Ελ - молярний коефіцієнт погашення;
С - концентрація речовини, що поглинає світло;
l - товщина поглинаючого шару забарвленого розчину.
Молярний коефіцієнт погашення являє собою оптичну щільність 1М розчину, поміщеного в кюветах з товщиною шару 1 див. Він дозволяє об'єктивно оцінити чутливість реакції. Так, наприклад, для слабоокрашенных речовин, таких, як хромат калію, молярний коефіцієнт погашення становить 400-500, а для дитизоната міді - близько 50 000. Звідси випливає висновок, що друге речовина перевершує за чутливістю перше приблизно в 100 разів [39].
Не всяка концентрація розчину може бути використана для фотометричних визначень. Оптимальними межами вимірювань на фотоелектричних приладах вважаються розчини, що поглинають від 5 до 90% світла [8], що відповідає від 0,02 до 1,0 оптичної щільності. Для фотоелектричних приладів, забезпечених підсилювачами і відповідним запасом по чутливості, ця межа може бути підвищений до оптичної щільності 2,0. Звідси, власне, виходять деякі рекомендації при вимірах: а) якщо густина розчину велика, то необхідно розбавити розчин або взяти кювету з більш тонким шаром; б) у разі малої щільності розчину потрібно переходити на кювету з більшою товщиною робочого шару.
Основний закон фотометрії дотримується в суворо визначених умовах. На практиці існують обмеження, причиною яких є відхилення від цього закону, викликані деформацією молекул, недостатньою монохроматичністю світла, зміною ступеня дисоціації іонів та іншими причинами.
При дотриманні основного закону фотометрії графік залежності між концентрацією забарвленого розчину і його оптичною щільністю виражається прямою лінією. При порушенні закону пропорційність спотворюється (рис. 66).
Рис. 66. Залежність оптичної густини від концентрації. 1 - при дотриманні основного закону фотоколориметрии; 2 - при його порушенні. Пояснення в тексті.
Переходячи до опису властивостей і особливостей окремих типів приладів для фотометричного аналізу, необхідно відзначити деякі досягнення і вдосконалення в їх пристрої, що відображають прогрес у науці і техніці.
У практиці зарубіжних лабораторій отримали широке поширення гемоглобинометры, сахариметры, билирубинометры, прилади для визначення насичення крові киснем, засновані на фотометричному методі вимірювання.
У зв'язку із збільшеним обсягом роботи лабораторій, а також з великим прогресом у техніці автоматичного аналізу з'явилися різні автоматизовані фотоколориметры і автоматичні аналізатори, забезпечені в якості вимірювального приладу фотоелектричним колориметром або спектрофотометром. Цікаво відзначити, що 70% відомих аналізаторів забезпечені не спектрофотометр, а більш простими фотоколориметрами [22].
Застосування волоконної оптики в фотоколориметрі дозволило створити проточну кювету, в якій об'єм розчину становить 0,002 мл [87].
В останні роки в якості джерела випромінювання в фотоелектричних пристроях використовуються оптичні квантові генератори (лазери). Лазери виявилися вельми перспективними тому, що їхнє випромінювання має властивість монохроматичності і спрямованості більш високої якості, ніж одержуване після кращих інтерференційних фільтрів [56]. Розроблені і вже випускаються спектрофотометри з використанням лазера в якості джерела світла.
Складність приладів для фотометричного аналізу зростає з переходом від візуальних фотометрів до фотоелектричним і далі до спектрофотометрам. У візуальних фотометрах використовується принцип зрівнювання освітленостей під контролем ока. Більш досконалими є фотоелектричні прилади. Вони мають ряд переваг перед візуальними фотометрами: а) виключається стомлюваність очей при масових аналізах, зникає суб'єктивна помилка при вимірах; б) фотострум, що виникає при потраплянні світла на фотоелемент, вимірюється стрілочними або іншого роду приладами і може бути виміряний набагато точніше, ніж при візуальному визначенні освітленості, що в підсумку підвищує точність аналізу; в) фотоелектроколориметр в принципі дозволяє проводити дослідження не тільки у видимій області світла.
В лабораторіях медичних установ отримали широке поширення фотоелектричні колориметры типів ФЕК. Спочатку випускалися колориметры ФЕК-М, ФЕК-Н-57. Потім на зміну їм прийшли ФЕК-56 і ФЕК-60. Останні два типи мають джерела випромінювання у видимій і ультрафіолетовій областях та їх правильніше назвати абсорбциометрами. На всіх ФЕК можна здійснювати також турбидиметрические вимірювання. При цьому треба мати на увазі, що турбидиметрические методи поступаються фотометричним з тієї причини, що розсіювання або поглинання світла дисперсною фазою залежить не тільки від кількості частинок, але і від їх форми, розміру, характеру. Для підвищення стабільності суспензій застосовують стабілізатори, наприклад желатину. Стабільність суспензій - необхідна умова для того, щоб можна було правильно провести дослідження. З часу підготовки досліджуваного зразка до закінчення його вимірювання частки речовини не повинні осідати або коагулювати в помітної ступеня, що може позначитися на точності вимірювання.
Фотоколориметры, як правило, мають такі елементи схеми: 1) освітлювач; 2) світлофільтри; 3) кювети; 4) фотоелементи; 5) пристрої для вимірювання або компенсації фотоструму.
Фотоелектроколориметри, залежно від методу вимірювання світлового потоку, діляться на два типи: а) фотоколориметры прямого відліку; б) фотоколориметры, що працюють за методом порівняння [15].
У першому випадку вимірюється пряма залежність фотоструму від світлового потоку. У приладах цього типу застосовується один фотоелемент (або інший приймач випромінювання).
У другому випадку порівнюються по диференціальній схемі два світлових потоку - вимірювальний та компенсаційний. У приладах цього типу в залежності від схеми можуть використовуватися як один, так і два фотоелемента. Фотоколориметры з використанням диференціальної схеми є більш стабільними і точними, оскільки менше залежать від коливань напруги мережі та інших перешкод.
У фотоелектричних фотометрах застосовують різні типи фотоперетворювачів, здійснюють перетворення світла в електричний струм. Як фотоперетворювачів застосовують фотоелементи двох різновидів - з замикаючим шаром (вентильні) і з зовнішнім фотоефектом (газонаповнені або вакуумні).
Вентильні фотоелементи не вимагають джерела живлення і можуть бути приєднані безпосередньо до вихідного электроизмерительному приладу. Фотоелементи із зовнішнім фотоефектом в поєднанні з підсилювачем дозволяють отримати більшу вихідну потужність і більший запас чутливості. До вентильним фотоелементів відносяться селенові та кремнієві.
Селеновий фотоелемент отримав широке розповсюдження завдяки деяким своїм позитивним якостям. Інтегральна чутливість цього фотоелемента досить велика, щоб використовувати його фотострум без посилення. Селенові фотоелементи мало інертні, швидко входять в режим», мають хороші експлуатаційні якості. Такими фотоелементами оснащені фотоколориметры ФЕК-М (рис. 67).
Рис. 67. Схема селенового елемента. 1 - залізний електрод; 2 - напівпровідник з селену; 3 - металеве кільце; 4 - електрод з катодно-розпорошеного металу; 5 - гальванометр.
Сутність роботи селенового фотоелемента полягає в наступному. При впливі світла електрони перескакують через замикаючий шар і потрапляють в добре провідну металеву плівку благородного металу. Струм замикається через гальванометр, залізну пластинку і повертається в напівпровідник (шар селену). Таким шляхом світлова енергія перетворюється в електричну і реєструється гальванометром. Між силою світла і фотострумом у відомих умовах дотримується строга пропорційність.
З фотоелементів із зовнішнім фотоефектом найбільш поширеними є киснево-цезієві і сурьмяно-цезієві.
Хоча фотоелементи цього типу відрізняються малою чутливістю і вимагають обов'язкового застосування підсилювальних схем, вони застосовуються у найбільш досконалих приладах завдяки чутливості до більш широкого інтервалу довжин хвиль, а також хорошим експлуатаційними якостями.
Світлофільтри із загального потоку світла пропускають лише певний інтервал довжин хвиль. Чим менше виділений світлофільтром ділянку спектра, тим більш вибірковими фотоелектричний прилад. Існують скляні світлофільтри, металлостеклянные (інтерференційні), плівкові, а також рідинні. В сучасних фотоколориметрах застосовуються в основному світлофільтри з кольорового скла і інтерференційні.
Інтерференційні світлофільтри дозволяють виділяти більш вузькі ділянки спектру, при цьому часто мають більший коефіцієнт пропускання. Так, пропускання багатошарових інтерференційних світлофільтрів доходить до 90% [24], у той час як скляні для тієї ж області мають пропускання менше.
Важливими характеристиками світлофільтру є довжина хвилі в максимумі пропускання і напівширина смуги пропускання. На рис. 68 і 69 показані ці співвідношення.
Рис. 68. Спектральні характеристики світлофільтрів.
а - широкосмуговий; б - вузькосмуговий
Рис. 69. Характеристика світлофільтру (спектральна крива).
Т - коефіцієнт пропускання; σ 0,5; λ - напівширина пропускання світлофільтра; λмакс - довжина хвилі в максимумі пропускання; λ - довжина хвилі.
Напівширина пропускання інтерференційних світлофільтрів дорівнює 10-12 нм. Інтерференційні фільтри являють собою багатошарову конструкцію з скляних пластинок, напыленных шарів металу і прошарку діелектрика. Схема інтерференційного світлофільтра наведена на рис. 70.
Рис. 70. Схема інтерференційного світлофільтра. 1 - плоскопараллельные захисні пластинки; 2 - шар діелектрика; 3 - напівпрозорі шари срібла або алюмінію.
Колір світлофільтра відповідає тому ділянці спектру, який цим світлофільтром пропускається. Щоб візуально оцінити колір інтерференційного світлофільтра, треба дивитися через кальку на добре освітлену білу папір. В табл. 9 показані рекомендовані кольори світлофільтрів для різних забарвлених розчинів.
Вибір світлофільтра для проведення кількісного дослідження проводять згідно з наступними принципами:
а) для забарвленого розчину вибирається той світлофільтр, колір якого є додатковим до кольору випробуваного розчину (див. табл. 9);
б) якщо відома спектральна область поглинання випробуваного розчину, то слід використовувати світлофільтр з максимумом пропускання, близьким до максимуму поглинання розчину. Такий підбір світлофільтра дозволяє отримати найкращу вибірковість і чутливість, а разом з тим і більшу точність.
