Механізм дії пеніциліну на мікроорганізми неясний. Вважають, що він порушує ферментативні системи обміну, процеси росту, розмноження.
Дія на бліду спирохету визначають як спирохетостатическое, спирохетоцидное; зустрічається і термін «дегенерирующее дія». Найкраще пеніцилін діє на мікроорганізми в стадії їх активного розмноження. В паралель із цим цікаво відзначити, що в клініці пеніцилін набагато ефективніше при активному, ніж при прихованому сифілісі.
Істотною умовою ефективної дії пеніциліну на мікроорганізми є тривалість дії. У дослідах in vitro на стафилококках показано, що при дії досить ефективної концентрації протягом 6 годин знищується 95-98% всіх мікроорганізмів; виживає, таким чином, 2-5%. Якщо збільшити дозу до 100 раз, то все ж не вдається вбити всі мікроорганізми. Збільшивши при початковій дозі в кілька разів час експозиції, вдається знищити мікроорганізми на всі 100%. Прямі досліди показують, що збільшення доз вище певної межі не тільки не підсилює дії пеніциліну, але навіть знижує його. Створюється, таким чином, переконання, що для кожної інфекції in vitro існує оптимальна доза, вище і нижче якої ефект погіршується (Гаузе). Це підтверджено і в дослідах на заражених сифілісом кроликів, оскільки показано, що надмірно високі дози справляють парадоксальний ефект. Вони не прискорюють, а уповільнюють загибель блідої спірохети.
Дуже серйозне питання про можливості створення пеніціллінові штамів блідих спірохет. Така можливість теоретично цілком імовірна. Описані поодинокі випадки клінічної резистентності до дії пеніциліну.
