При випробуванні антирахитических властивостей препарату виявилося, що 25-ДХК в 1,5 рази активніше вітаміну Д3. Він значно сильніше стимулював абсорбцію кальцію (Ponchon, De Luca, 1969 і ін). Якщо вітамін Д проявляє свою дію тільки через 10 год, то 25-ДХК - через 4 год після введення тваринам. Крім того, в ядрах клітин слизової тонкого кишечника 25-ДХК зумовило більш швидку, ніж вітамін Д3, транскрипцію ДНК в РНК.
У дослідах in vivo та in vitro (Ponchon, De Luca, 1969) встановлено, що печінка є єдиним органом, в якому здійснюється окислення вітаміну D3 (холекальциферолу) у 25-гидроксихолекальциферол. Аналогічного перетворення в печінці піддається ергокальциферол (вітамін Д2) з утворенням 25-гидроксиэргокаль-циферола. Антирахитическая активність цього метаболіту так само, як і 25-ДХК, у 1,5 рази вище, ніж вихідного вітаміну Д2. В перші години після введення вітамін Д3 (або Д2) акумулюється в печінці, де під впливом гідроксилази приєднується гидроксильная група до вуглецю в положенні 25 (бічний ланцюга молекули вітаміну) з утворенням 25-ДХК (Suda a. oth., 1969; рис. 2). Складалося враження, що є вагомі підстави вважати 25-ДХК фізіологічно активною формою вітаміну Д3 в організмі. Однак дослідження Е. Kodicek а. oth. (1970) показали, що і цей метаболіт у тканинах зазнає подальші зміни. Так, після внутрішньовенної ін'єкції міченого подвійною міткою (Н3 і С14) вітаміну Д при детальному хроматографічному розділенні неомыляемой фракції плазми крові і тканин курчат був виявлений метаболіт вітаміну Д («пік Р»), більш полярний, ніж 25-ДХК. Причому виявилося, що попередником в синтезі цієї окисленої форми служив 25-ДХК. Встановлено, що у цієї речовини ставлення Н3 і С14 нижче, ніж у вихідного вітаміну, за рахунок втрати тритію у вуглецю в положенні 1 (кільце А).
D. R. Fraser, Тобто Kodicek (1970) зробили цікаве повідомлення. При інкубації гомогенатов різних органів і тканин (слизової кишечника, нирок, печінки, кісткової тканини, м'язів, тимуса і т. д.) тільки нирки мали здатність окислювати 25-ДХК в більш активну форму, що було підтверджено також в експерименті in vivo. Введення 25-ДХК тваринам з видаленими нирками не викликало освіти окисленої форми вітаміну Д3, в той час як у контрольних щурів ця форма виявилася. Таким чином, була доведена унікальна роль нирок в процесі перетворення 25-ДХК в більш полярне з'єднання. Надалі така здатність була використана для отримання нового метаболіту. Виявилося, що нирковий гомогенат за одну годину інкубації окисляє більше 15% доданого в середу попередника - 25-ДХК. Це дозволило отримати достатню кількість цієї речовини для подальшого дослідження. Незабаром воно було очищено і ідентифіковано як 1,25-дигідро-ксихолекальциферол (Lawson a. oth., 1969).
Випробування на стимуляцію абсорбції кальцію показало, що 1,25-дигидроксихолекальциферол (1,25-ДГХК) за фізіологічної активності в 4-6 разів перевершує вітамін Д3 і в 2-3 рази активніше, ніж 25-ДХК. Незабаром цей же активний метаболіт вітаміну Д (1,25-ДГХК) отримали в лабораторіях Каліфорнійського і Вісконсинського університетів. В мітохондріях нирок було виявлено спеціальний фермент, що каталізує окислення (Myrtle, Norman, 1971; Frolik, De Luca, 1971 та ін). Цими роботами була остаточно доведена роль нирок у синтезі 1,25-ДГХК. Мабуть, 1,25-дигидроксихоле-кальциферол і є тією фізично активною формою вітаміну Д в організмі, яку вчені довго і наполегливо шукали (Милосердова, 1971).
Дослідженнями М. Garabedian з співавторами (1972) доведена виключно велика роль паращитовидних залоз в нирковому синтезі 1,25-диоксихолекальциферола з 25-оксихолекальциферола. В експерименті у тварин з віддаленими околощитовидными залозами через 40 год після тиреопаратэктомии різко знижувалася вироблення 1,25-ДГХК з 25-ДХК з одночасним збільшенням неідентифікованого полярного метаболіту Va. Введення тваринам 40 од. екстракту паращитовидних залоз відновлювало синтез 1,25-ДГХК до норми. Отже, цей гормон є тропином, контролюючим освіта в нирках гормональної форми вітаміну D - 1,25-ДГХК.
Таким чином, встановлено, що в організмі вітамін Д зазнає ряд складних змін з утворенням фізіологічно активної форми, завдяки якій здійснюється основна функція вітаміну Д в організмі - всмоктування кальцію в кишечнику та його мобілізація з кісткової тканини.
