Електрофорез - це рух заряджених частинок під дією електричного поля. Оскільки різні частинки можуть володіти різними величинами зарядів і відчувати при русі неоднакове опір середовища, швидкість їх переміщення може бути різною. На цьому принципі й засновано застосування електрофорезу в якості методу розділення речовин.
З початку 50-х років почалося широке розповсюдження методу електрофорезу спочатку на папері, а потім послідовно на інших підтримуючих середовищах і в гелях.
В даний час завдяки високій ефективності поділу, широких можливостей застосування, а також простоті і дешевизні використовуваної апаратури методи препаративного і аналітичного електрофорезу знаходять дуже широке застосування в біології і медицині для виділення та дослідження властивостей, головним чином високомолекулярних біополімерів - білків, протеидов, поліпептидів і нуклеїнових кислот.
Білки і нуклеїнові кислоти є амфотерними електролітами і містять здатні до іонізації як кислотні, так і основні групи, ступінь іонізації яких, природно, залежить від рН середовища. Загальний заряд молекули визначається сумою розташованих на її поверхні позитивних і негативних зарядів. Якщо ця сума дорівнює нулю, молекула не буде рухатися під дією електричного поля. Значення рН розчину певного складу, у якому ця речовина не переміщається в електричному полі, називається ізоелектричної точкою даної речовини. Изоэлектрическая точка є важливою характеристичної константою білків. При рН середовища вище ізоелектричної точки сумарний заряд молекули стає від'ємним і вона буде рухатися у напрямку до анода. При рН нижче ізоелектричної точки молекула рухається до катода.
Для розуміння природи електрофоретичної рухливості важливо уявляти собі, що електрофорез завжди проводиться в буфері, тобто в розчині електроліту. У цих умовах кожен заряд екранований дифузної оболонкою протиіонів. Згідно теорії Дебая-Хюккеля товщина цієї оболонки залежить від іонної сили розчину. У дуже розбавлених розчинах при іонній силі нм<0,01 її товщина перевищує розміри білкової молекули і тоді електрофоретична рухливість залежить від сумарного заряду і радіусу білкової молекули, тобто залежить від кореня кубічного з молекулярного ваги. У концентрованих сольових розчинах при нм>0,1, в яких практично і проводиться електрофорез, дебаевская оболонка стає менше 10 А (1 нм), тобто менше розмірів білкової молекули. При цьому створюються умови при яких електрофоретична рухливість білків абсолютно не залежить від їх молекулярних ваг. Цей надзвичайно важливий висновок справедливий для всіх видів електрофорезу за винятком електрофорезу в гелі, що володіють ефектом молекулярного сита (ссфадекс, поліакриламід, тобто поєднання електрофорезу з гельфильтрадией, і випадків застосування спеціальних прийомів, наприклад проведення електрофорезу в присутності іонів додецилсульфату).
Електрофоретична рухливість спрощено може бути описана наступним виразом:
U=S/E·t
де U - рухливість частинки в см2ХВ-1Хс-1;
S - пройдений часткою шлях в см;
Е - напруженість електричного поля в/см;
t - час в секундах, за який частинкою був пройдений шлях 5.
Рухливість білків лежить в межах (0,1-1,0) X10-4 см2Х B-1Xc-1.
Розрізняють два принципово відмінних способи проведення електрофорезу. Це фронтальний електрофорез або електрофорез з рухомою межею, званий іноді електрофорезом у вільному середовищі за Тизелиусу, і зональний електрофорез [28].
Метод фронтального електрофорезу має низку серйозних недоліків, в даний час повністю витіснено з ужитку різними видами зонального електрофорезу на підтримуючих середовищах.
Ідея зонального електрофорезу полягає в тому, що розчин досліджуваної суміші речовин вводиться в середу, що містить електроліт, у вигляді досить вузької зони. За рахунок відмінностей в електрофоретичної рухливості окремих складових суміші вони поділяються також у вигляді вузьких зон. Зрозуміло, що в цьому випадку роздільна сила методу буде тим вище, чим вже нанесена вихідна зона і чим нижче швидкості поступальної дифузії молекул поділюваних речовин. Дуже важливою вимогою стабілізації зон є проведення поділу в умовах, що виключають виникнення конвекцією.
В якості підтримують середовищ для зонального електрофорезу були використані папір, порошки скла, целюлози і крохмалю, плівки з ацетилцелюлози, а також крохмальний, агаровий, агарозный, полиакриламидный та інші гелі. Застосування гелів завдяки поєднанню електрофорезу з ефектом гельфильтрации, чутливим до величин молекулярних ваг, призвело до суттєвого підвищення роздільної сили методу. Ще більшого збільшення ефективності фракціонування сумішей речовин вдалося досягти послідовним поєднанням методу електрофорезу з хроматографією (двомірний електрофорез) і з иммунопреципитацией (иммуноэлектрофорез).
Раніше інших видів зонального електрофорезу був запропонований електрофорез на папері, одержав надзвичайно широке поширення не тільки в науково-дослідних, але і клінічних лабораторіях, і не втратив свого значення і зараз, незважаючи на появу ряду нових методів, що володіють більш високою роздільною здатністю.
Принцип аналітичного варіанти електрофорезу на папері полягає в тому, що на смужки фільтрувального паперу шириною 1-3 см, просочені буферним розчином, вузькою смугою наносять досліджувану суміш білків або сироватку крові в кількості не більше 5 мкл на 1 см ширини паперу і до кінців папери прикладають напругу постійного струму. В подальшому розділилися зони речовин, що фарбують, ідентифікують і проводять кількісне визначення. Відомо безліч конструкцій апаратів для аналітичного електрофорезу на папері. Багато з них виробляються як у нас в країні, так і зарубіжними фірмами.
Для проведення електрофорезу на папері в рівній мірі придатні обидва типи продукції в СРСР хроматографічного паперу марки Б (швидка) і М (повільна). Рекомендується кожну серію експериментів проводити на папері однієї партії. З імпортних паперів найбільш популярні папери фірми «Ватман» (Англія). Хороші результати можна отримувати на паперах Ватман № 1, 2 і ЗММ.
Нанесення на папір вузької смуги проби можна робити швидким штрихом мікропіпетки з заокругленим або плоским кінцем, що, однак, вимагає певної вправності і не завжди дає відтворювані результати. Краще це робити шляхом дотику до паперу ребра покривного скла, за яким була розмазана крапля досліджуваної проби. Ще краще виготовити нескладне пристосування (рис. 102), у якому проба наноситься між двома тонкими (00,1 - 0,2 мм) паралельно розташованими на відстані приблизно 0,5 мм тяганиною з нержавіючої сталі або ніхрому. Власник встановлюється в необхідному положенні над вологим папером, після чого натисканням кнопки проводиться опускання дротяної рамки до дотику її з папером.
Рис. 102. Пристосування для нанесення проби на папір.
Для усунення впливу на поділ продуктів електролізу і зміни рН буферів в електродних судинах найбільшого поширення набула лабіринтова система. Електричний контакт між електродним посудиною досить великого обсягу і проміжною судиною здійснюється за допомогою просочених буфером ґнотів з паперу або азбестового шнура, а також заповнених буфером V-образних трубок з кінцями, закритими скляній або звичайною ватою. Більш ефективно, але й більш громіздко застосування безперервного протоки буферного розчину через електродні судини самопливом або за допомогою циркуляційного насоса з наступним об'єднанням порцій буфера, що пройшли через анодний і катодний судини. При цьому можливо багаторазове використання одного і того ж буфера. Цей метод найчастіше застосовується в препаративних варіантах електрофорезу.
В якості електродів краще всього користуватися платинової дротом Діаметром 0,3-0,8 мм. Хлорсеребряные електроди (срібна дріт, покритий шаром хлору методом електролізу) необхідно від досвіду до досвіду поперемінно використовувати в якості анода або катода.
Важливою умовою отримання чіткого поділу зон є запобігання або максимальне зниження випаровування рідини з поверхні паперу. Випаровування призводить, по-перше, до підвищення в папері концентрації солей, а отже, зниженню її електричного опору і, по-друге, до безперервного надходження в папір рідини з електродних судин (реофорез), що викликає зміщення білкових зон. При використанні невисоких градієнтів напруги близько 2-5 В/см нагрівання смужок паперу не занадто великий для зниження випаровування достатньо проводити електрофорез у вологій камері. Тому камера для електрофорезу повинна бути герметичною і, можливо, меншого обсягу, щоб стан насичення водяними парами відбувалося швидко. Кришка камери повинна бути злегка закругленої або похилої, щоб конденсуються на неї краплі води стікали по стінках, а не падали на папір. Форма камери може допускати вертикальне, похиле, П-образне, у вигляді перевернутої букви V або горизонтальне положення папери. Застосування вертикального або похилого положення папери зазвичай пов'язане з бажанням зменшити габарити приладу. Практика показала, що при горизонтальному положенні паперу, що лежить на гострих виступах дна камери, щоб уникнути затікання під неї рідини вдається домогтися мінімального обсягу камери і створити найкращі умови для поділу.
Вітчизняна промисловість випускає ряд моделей приладів для аналітичного електрофорезу на папері. В лабораторіях застосовується також апаратура, що випускалася раніше, в подальшому знята з виробництва.
