Незабаром після застигання агару колодязі заповнюють еквівалентними обсягами реагуючих речовин. В центральний поміщають еякулят (в якості антигену), а бічні - сироватку крові жінки і чоловіки, слиз цервікального каналу і т. д. в будь-якій комбінації розчину.
Цими речовинами колодязі заповнюють за допомогою індивідуальних шприців або микропипеток на 1 мл. Для наповнення колодязя досить 0,01 мл реагенту. Заповнені таким чином скла витримують в чашках Петрі на сірниках, у вологому середовищі (мокра шматочки марлі). Ці чашки можна зберігати при кімнатній температурі або в холодильнику. Через 24 години (в основному раніше) преципітація закінчується.
Після закінчення реакції покривне скло відокремлюють від агару пальцем, поступово зрушуючи його. Потім предметне скло поміщають у чашку Петрі з дистильованою водою на 1 годину, поки все що екстрагуються речовини зникнуть, для чого препарат легко похитують. Потім можна переглядати смуги преципітації, краще в темному полі, під кутом до скла. Проте для цього потрібен певний навик. Для контрастності ліній преципітації препарат можна фарбувати, для чого застосовують тиозин червоний (протеїнова забарвлення).
Промиті вологі скла (до їх висушування) поміщають у розчин тиозина червоного (в 100 мл 1% оцтової кислоти розчиняють 0,1 г барвника) на 1 годину. Час фарбування залежить від товщини шару агару та інтенсивності смуг преципітації. Після фарбування кольоровий фон можна видалити промиванням в 1% розчині оцтової кислоти. Потім препарат висушують і переглядають за допомогою лупи, мікроскопа з малим збільшенням або макроскопічно.
Досить хороший ефект досягається при попередньому фарбуванні. До 0,1 мл антитіл (сироватка крові, слиз цервікального каналу і т. д.) додають 0,1 мл кристалічного гематоксиліну (кілька кристаликів). Перемішують описаним вище способом, потім залишають на скляній пластинці до придбання розчином темно-пурпурного забарвлення (Katsh, 1967). До 0,1 мл антигену (еякуляту) на предметному склі додають 1 краплю 5,7% сірчаної кислоти. Кислоту і антиген перемішують шляхом руху у шприці або микропипетке (Katsh, 1967). Незважаючи на додавання сірчаної кислоти, рН якого дорівнює 1,0, не відбувається різкої зміни концентрації водневих іонів еякуляту. Володіючи властивістю буферних розчинів, рН сперми при цьому стає рівним 6,9-7,2 (в середньому 7±0,05). рН сироватки крові та слизу цервікального каналу через 10 хвилин після додавання гематоксиліну (у кількостях, що застосовуються за методикою) також відповідає нейтральної реакції.
Спочатку в бічні колодязі покривного скла вводять розчини сироватки крові чоловіка і жінки і секрету шийки матки, а через 45 хвилин заповнюють антигеном центральний колодязь. Реакція розвивається і проходить, як і раніше, у вологому середовищі в чашках Петрі, але в даному варіанті протягом кількох годин. Подальша обробка проводиться за описаною вище методикою. Після висушування препарату смуги преципітації добре помітні неозброєним оком і можуть бути сфотографовані без спеціального пристрою.
Ouchterlony (1948) виділяв три види реакції: ідентичності та неідентичності часткової ідентичності: 1) смуги преципітації зливаються і стають чіткими. Це вказує на тотожність порівнюваних реагуючих речовин; 2) смуги преципітації перехрещуються між собою. Це свідчить про неспецифічність реакції; 3) смуги преципитаций, зливаючись, утворюють «шпору». В даному випадку можна говорити про часткове спорідненість реагуючих речовин.
