В залежності від властивостей об'єкта світло змінює свої фізичні властивості - колір (довжину хвилі), яскравість (амплітуду хвилі), фазу, використовуються в сучасних мікроскопах для створення контрасту.
Для мікроскопії пофарбованих об'єктів користуються найпростішим з відомих мікроскопів - так званим звичайним (рис. 1). Так як око і фотопластинка легко вловлюють відмінності в забарвленні минулого променя, не потрібно ніяких додаткових зусиль для розгляду і зйомки кольорового зображення. Колір зображення має величезне пізнавальне значення, бо по взаємодії об'єкта з фарбою можна судити про його хімічною природою. Змінюючи режим фарбування, вводячи додаткові обробки розчинниками, фіксаторами, коагулянтами та іншими речовинами (див. Гістологічна техніка), домагаються дуже точних, в тому числі кількісних, знань про природу об'єкта і його химизме. На цьому засновані бурхливо розвиваються гісто - і цитохимия, які немислимі без мікроскопії. Багато діагностичні прийоми практичної медицини засновані на мікроскопії забарвлених об'єктів. У патогістології, інфекційної патології, паразитології застосовують такі специфічні барвники, методи обробки мікропрепаратів і режими забарвлення, що часто буває досить одного погляду в мікроскоп для постановки діагнозу або оцінки результатів лікування.
Найбільш легко піддаються фарбуванню фіксовані, убиті препарати. Такі нерухомі препарати можуть бути з високою точністю розглянуті і сфотографовані через мікроскоп, але вони не дають можливості оцінити різні форми життєдіяльності микроскопируемого об'єкта (рух, злиття, фагоцитоз та інші). Відомі барвники, які зв'язуються з живими клітинами, не порушуючи їх життєдіяльності.
Вітальна (прижиттєва) мікроскопія показує, що багато структури живої клітини порівняно мало змінюються при вмілій фіксації і подальшому фарбуванні. Цим підтверджується висока наукова цінність інформації, одержуваної за допомогою мікроскопії забарвлених об'єктів. Вітальна мікроскопія можлива і без фарбування, якщо у звичайний мікроскоп ввести так званий темнопольний конденсор. Він висвітлює об'єкт так, що в око спостерігача потрапляють тільки ті промені, які розсіялися на частинках об'єкта і тим самим змінили напрям свого поширення. Промені, які пройшли через фон без розсіювання, очей не потрапляють. Тому частинки об'єкта світяться і яскраво виділяються на темному фоні (темному полі). Частинки об'єкта добре видно, навіть якщо їх розміри менше разрешаемого відстані.
Темнопольная мікроскопія забезпечує найбільший можливий контраст зображення, чіткість його і корисне збільшення помітно нижче, ніж при звичайній М. Темнопольная М. успішно застосовувалася для вивчення спірохет, лептоспір та інших слабо офарблюються мікроорганізмів. При роботі з гістологічними препаратами вона непридатна.
Технічно самостійним варіантом темнопольної мікроскопії є ультрамикроскопия, при якій дрібні вивчаються частинки висвітлюються потужним боковим пучком світла і видно точками на чорному тлі. Ультрамикроскопия дозволяє підраховувати частинки, оцінювати їх розміри та інші властивості. Застосовується для вивчення колоїдних розчинів, аерозолів, суспензій.
В останні роки темнопольная мікроскопія застосовується все рідше, так як з'явилися два нових типи контрастують приладів зі значно кращими характеристиками - фазово-контрастний (рис. 2, а і б) і амплітудно-контрастний мікроскопи. Технічно вони схожі, але в них використовують різні зміни світлового променя в об'єкті. Промінь, який пройшов через фон зразка, в ідеальному випадку не зазнає ніяких змін. Він проходить через точно визначені ділянки об'єктива. Промінь, що пройшов через об'єкт, що піддається дифракції, тобто розпадається на пучки зменшенням інтенсивності, які виходять з об'єкта під різними кутами. Інші властивості променя (амплітуда, довжина хвилі, фаза) змінюються в різних ступенях в залежності від особливостей об'єкта.
Майже всі живі мікроскопічні об'єкти виглядають у звичайному мікроскопі ледь помітними, прозорими, бо вони майже не змінюють ні амплітуди, ні кольору пройшов через них променя.
Вони змінюють тільки фазу його хвилі, але ця зміна не вловлюється ні оком, ні фотопластинки. Пучок променів, дифрагованих об'єктом і зсунутих їм по фазі, проходить через ті ділянки об'єктива, де не можуть пройти прямі, недифрагированные промені фону. Практично неважко визначити, де саме пройдуть ці промені. Якщо накрити цю ділянку однієї з лінз об'єктива напівпрозорої пластинкою, здатною змінити фазу, інтенсивність, колір або всі ці три властивості разом, то зображення фону змінить свою фазу, зменшиться його яскравість або перетвориться колір. Промені, що пройшли через об'єкт і відхилені (дифраговані) їм, обійдуть вкладену в об'єктив пластинку і, отже, не придбають тих властивостей, які придбали, пройшовши через пластинку, промені фону. В результаті різниця між променями фону та об'єкта зросте. Якщо різниця фаз між променями фону та об'єкта досягає J/4 довжини хвилі, то в кінцевому зображенні виникає помітний для ока і фотопластинки контраст: темний об'єкт на світлому фоні або, навпаки, в залежності від структури платівки, яку в цьому випадку називають «фазової». Якщо ж платівка змінює головним чином яскравість та колір фону, то такий мікроскоп слід назвати амплітудно-контрастним (велике поширення набуло більш короткий, хоча і не зовсім правильна назва «аноптральный»). Таким чином, різниця між фазово-контрастним і амплітудно-контрастним мікроскопом визначається властивостями пластинки в об'єктиві, що змінює властивості недифрагированных променів фону. Зображення, побудовані цими мікроскопами, значно яскравіше і багатше деталями (рис. 3 і 4), ніж темнопольные картини.
З появою фазово - і амплітудно-контрастних мікроскопів вітальна мікроскопія отримала прекрасну техніко-методичну базу, можливості якої близькі до граничних для світлової оптики. Ніякої фіксації чи фарбування об'єкта ці прилади не вимагають. Сучасна вітальна М. надзвичайно розширила наші знання про поведінку і динаміці живих мікрооб'єктів в природних і лабораторних умовах проживання та експерименту. Експрес (рапід) і уповільнена (цейтрафферная) микрокиносъемка зробили доступними для дослідження процеси, швидкість протікання яких занадто велика або занадто мала для візуального спостереження.
Випускаються промисловістю фазово-контрастні та амплітудно-контрастні (аноптральные) пристрої недорогі, легко монтуються на серійних мікроскопах; використання їх не становить труднощів. Ці прилади, безсумнівно, будуть знаходити все нові області застосування, як у наукових дослідженнях, так і в медичній практиці.
Ультрафіолетова мікроскопія заснована на здатності деяких речовин вибірково поглинати ультрафіолетові промені з певною довжиною хвилі. Це дозволяє наочно демонструвати і вивчати, у тому числі кількісно, розподіл речовин у живих клітинах або фіксованих препаратах. Так, наприклад, білки і нуклеїнові кислоти однаково прозорі для видимого світла; розглядаючи незабарвлену клітку у видимому світлі, не можна визначити, де розташований білок або нуклеїнова кислота. Але ультрафіолетові промені певної довжини нуклеїнова кислота поглинає значно сильніше, ніж білок. Тому в ультрафіолетовому мікроскопі ділянку, що містить нуклеїнову кислоту, виглядає значно темніше. Так як ультрафіолетові промені безпосередньо не сприймаються оком, доводиться застосовувати спеціальні перетворювачі світу. Ультрафіолетова мікроскопія технічно значно складніше звичайної світлової, її апаратура дорожче і методика тонше. Незважаючи на це, її застосування виправдано, так як наукова значимість швидкого топографічного опису хімічного складу живої клітини досить велика.
Набагато більш доступна і перспективна люмінесцентна мікроскопія (див.), широко застосовувана нині в науково-дослідних і клініко-діагностичних лабораторіях. При цьому живий об'єкт обробляють спеціальними барвниками, які, будучи висвітлено синім, фіолетовим або ультрафіолетовим світлом, починають світитися, випромінюючи більш довгі хвилі (зелені, жовті). Колір порушеної вторинного світіння залежить від хімічних властивостей об'єкта та введеного в нього барвника.
Поляризаційна мікроскопія заснована на зміні площини коливань світлової хвилі після проходження через кристали. У практичній медицині не застосовується.
Сучасна М. вимагає застосування різноманітної допоміжної апаратури. Нагрівальні столики і термостати дозволяють витримувати й спостерігати об'єкт
тривалий час при заданій температурі. Для тривалого вирощування мікробів або тканинних культур в полі зору сильного об'єктива служать різноманітні мікрокамери. Окулярні і об'єктивні мікрометри роблять можливими точні вимірювання мікрооб'єктів. Промисловість випускає мікроманипулятори (див.) для операцій на микрообъектах. Для отримання стереоскопічного зображення при збільшеннях до 100 разів призначені бінокулярні лупи (див.) і стереомікроскопи (рис. 5). Широко виробляється і використовується апаратура для мікрофотографії і микрокиносъемки (рис. 6). См. також Мікроскопічна техніка.
